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淺析熒光素酶檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟

瀏覽次數(shù):756發(fā)布日期:2022-06-23
  熒光素酶檢測試劑盒是生物體內(nèi)催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱,可以從細(xì)菌、螢火蟲、海星等生物中提取出來。熒光素酶的這種催化底物產(chǎn)生自發(fā)熒光的特性可以靈敏地檢測基因的表達(dá)。
 
  可分別催化各自的底物發(fā)出不同顏色的熒光,且兩種光吸收波長不同,檢測互不干擾,因此可在同一個(gè)化學(xué)反應(yīng)體系中同時(shí)使用,作為雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)使用,已成為研究轉(zhuǎn)錄因子參與基因調(diào)控的有效手段,通過對(duì)啟動(dòng)子DNA片段的分析,驗(yàn)證啟動(dòng)子結(jié)合元件的反式激活能力,探討轉(zhuǎn)錄因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的分子機(jī)制。
 
  熒光素酶檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟:
 ?。?)用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(若目標(biāo)是檢測miRNA及其靶基因的靶向作用,則需要預(yù)測兩者結(jié)合位點(diǎn))。
 ?。?)設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段,將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(如pGL3-basic)中。
 ?。?)篩選陽性克隆,測序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。
 ?。?)擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒,提純備用。同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對(duì)照,提純備用。
 ?。?)培養(yǎng)293(或其它目的細(xì)胞),并接種于24孔板中,生長10-24小時(shí)。
 ?。?)將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
 ?。?)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48h后,棄去培養(yǎng)基,用100μl1XPBS洗1遍。
 ?。?)傾斜96孔板,吸干剩余的PBS。
 ?。?)去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB,使用前放到常溫。
  (10)每孔加50μl稀釋好的1XPLB,搖床常溫條件下?lián)u15min,進(jìn)行裂解。
 ?。?1)白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟(10)的上清液10μl,加入100μl預(yù)先混好的LARII,2s后測數(shù)據(jù)。
 ?。?2)每孔添加100μl預(yù)先混好的Stop&GloReagent,靜止2s后,測數(shù)據(jù)。
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